Forschung - Biotechnologie

Biotechnologie — AK Scheper

Verschiedene Themenfelder der modernen Biotechnologie werden im Arbeitskreis behandelt: Bioprozesstechnik, Aufarbeitung, Enzymtechnik, Biosensorik, Bioanalytik, Chiptechnologie und Bioinformatik. Die Arbeiten werden von den Arbeitsgruppenleitern PD Dr. Cornelia Kasper, Dr. Sascha Beutel, Dr. Frank Stahl und Prof. Dr. Bernd Hitzmann, die alle auch eigene Forschungsgebiete haben, mit betreut.


Arbeitsgruppe "Tissue engineering"

PD Dr. rer. nat. Cornelia Kasper

Zellkulturtechnik

In der modernen Biotechnologie sind in den letzten Jahren eine Vielzahl von Verfahren und Produkten im Bereich der medizinischen Biotechnologie (rote Biotechnologie) entwickelt worden. Die medizinische Biotechnologie umfasst die Herstellung und Isolierung von Proteinen, Vakzinen und anderen biologisch aktiven Hochwertstoffen für die Anwendung in Diagnostik und Therapie, die Gentherapie und die Produkte und Behandlungsmethoden im Bereich der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering. Für alle genannten Bereiche kommen Zellen zum Einsatz. Diese Zellen können entweder selbst das Ziel sein (Gentherapie und Tissue Engineering) oder aber auch für die Produktion oder Testung von Biopharmaka eingesetzt werden.

Säugerzellkultivierung

Die Produktion von Proteinen für therapeutische Zwecke wird heute häufig unter Einsatz von Säugerzellkulturen durchgeführt. Hierbei kommen verschiedene Zellen und Bioreaktorsysteme sowie Kultivierungsmodi zum Einsatz.
Für die Herstellung von Biopharmazeutika (Proteine, Antikörper) werden heute vorwiegend genetisch modifizierte Säugerzellen (CHO chinese hamster ovary, BHK baby hamster kidney, und Hybridomzellen eingesetzt. Die Kultivierung dieser Zellen ist aufwendig und erfordert hochspezielle Geräte und Methoden. Für die optimale Verwendung von Säugerzellen für die Produktion von pharmazeutisch wichtigen Substanzen müssen sowohl die Zellsysteme als auch der gesamte Produktionsprozess genau charakterisiert und optimiert werden. Hierzu gehören die Entwicklung geeigneter Bioreaktoren, in denen die Zellen vermehrt werden sowie die Optimierung der Kultivierungsbedingungen (Medienzusammensetzung, Temperatur, Scherstress etc.). Systematische Untersuchungen dieser Prozessparameter können zusammen mit der Online-Analytik und der Kontrolle von essentiellen Komponenten dazu beitragen, die Raum-Zeit Ausbeuten zu steigern.

Tissue Engineering

Das Tissue Engineering ist ein sehr dynamisch wachsendes, vergleichsweise „junges“ Forschungsgebiet in der medizinischen Biotechnologie. Ziel des Tissue Engineering ist es, Gewebe- oder Organdefekte durch den Einsatz künstlich erzeugter Gewebe zu behandeln/heilen. Hierzu werden Zellen des entsprechend geschädigten Gewebes/Organs zunächst entnommen und in geeignete Kulturbehälter gebracht. Die Gewebezellen werden so außerhalb des Organismus (extracorporal) auf einer Biomatrix gezüchtet. Die Biomatrix dient als Stützgerüst und verleiht dem entstehenden Gewebekonstrukt die dreidimensionale Struktur. Nach erfolgter Vermehrung wird das künstliche Gewebe in den Defekt eingebracht. Optimaler Weise handelt es sich bei den Zellen um patienteneigenes "Material" (autologe Zellen), da somit eine Abstoßungsreaktion bei der Reimplantation des künstlichen Gewebekonstruktes umgangen wird. Heute rückt auch der Einsatz von (adulten) Stammzellen immer stärker in den Fokus der Forschung. Die Stammzellen können aus verschiedenen „Quellen“ z.B. Knochenmark, Fettgewebe, Blut) gewonnen werden. Die Stammzellen können dann anschließend auch vermehrt und gezielt in verschiedene Gewebetypen (Knorpel, Knochen, Nervenfasern u.a.) differenziert werden. Es gilt vor allem für das Tissue Engineering geeignete Matrices zu entwickeln, spezielle Bioreaktorsysteme zu entwickeln, die die funktionelle 3D-Gewebebildung erlauben sowie die Kultivierungsbedingungen (Medienzusammensetzung, Zusatz von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, mechanische Belastung etc.) zu optimieren.

Ausführliche Zusammenfassung "Tissue engineering" als PDF auf Deutsch oder in English herunterladen.


Arbeitsgruppe "Functional Food und Bioprozesstechnik"

Dr. rer. nat. Sascha Beutel

In der Ernährungsindustrie müssen neue Wege beschritten werden, um eine gesunde Ernährung der Bevölkerung zu gewährleisten, die sich zunehmend einseitig und unausgewogen ernähren. Das Konzept der Functional Foods, Nahrung mit einer zusätzlichen gesundheitlichen Wirkung zu versehen, stellt einen Lösungsansatz für dieses Problem dar. Das Potential zur Entwicklung von Functional Food ist groß, da viele natürliche Substanzen, wie z.B. sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe physiologisch hochaktiv sind. Die Forschung konzentriert sich heute v.a. auf den Nachweis der gesundheitlichen Wirkung, der Einbindung der Functional Ingredients in Lebensmittelmatrizes und der Prozessentwicklung. Das am TCI beheimatete Kompentenzzentrum Functional Food für Niedersachsen bietet Unterstützung für Akteure aus Industrie und Forschung und leistet Networking für diesen Bereich.

Viele solcher Functional Ingredients lassen sich z.B. aus nachwachsenden Rohstoffen isolieren oder mit Hilfe von Mikroorganismen herstellen. Dies zeigt die enge Verflechtung des Functional Food-Bereiches mit der modernen Biotechnologie. Für die Entwicklung und Optimierung von Bioprozessen, sowohl Up- als auch Downstream, sowie die geeigneten bioanalytischen Nachweisverfahren stehen am TCI Infrastruktur und Knowhow zur Verfügung.

Näheres auf: http://www.functional-food.org.


Arbeitsgruppe "Chiptechnologie"

Dr. Frank Stahl

Am 26.06.2000 gaben das Human Genome Project (HGP) und Craig Venter (Celera Genomics) gemeinsam die vollständige Entschlüsselung des menschlichen Genoms bekannt. Durch das rasant fortgeschrittene Genom-Projekt - die komplette Sequenz des menschlichen Genoms wurde fünf Jahre früher entschlüsselt als ursprünglich geplant - ist inzwischen ein Punkt erreicht, an dem die Zahl der bekannten Gensequenzen das Wissen über entsprechende funktionale Daten weit übersteigt. In einem gewissen Gegensatz zu dieser Vielzahl von DNA-Sequenzeinträgen in Datenbanken steht also die Tatsache, dass es keine entsprechenden Kenntnisse zur Funktion bzw. funktionalen Zusammengehörigkeit der betreffenden Gene gibt (Ermolaeva et al., 1998). Man schätzt, dass von nur etwa 30% der humanen Gene die Funktion bekannt ist. Daher reichen konventionelle Methoden zur Analyse von Genexpression nicht mehr aus, die Anforderungen der beginnenden postgenomischen Ära zu erfüllen. Zur Analyse der Genexpression vieler Gene oder ganzer Genome in einem Experiment werden massiv parallele Ansätze notwendig. Dieser Herausforderung werden nur wenige Techniken gerecht. Als voraussichtliche beste Methode für den stattfindenden Übergang der Genforschung von structural zu functional genomics und die damit verbundene Analyse von Genexpression auf breitester Ebene bietet sich heute die Verwendung von sogenannten DNA-Chips an, mit denen man in der Lage ist, die Genexpression quantitativ auf genomischer Ebene zu erfassen. Zellspezifische Antworten auf Genexpressionsebene können damit in einem bisher nicht gekannten Ausmaß analysiert werden und geben Einblicke in die molekulargenetischen Veränderungen innerhalb der Zelle.

Diese Technologie, die als DNA Chiptechnologie oder DNA-(micro)array bezeichnet wird, wird von großer Bedeutung für die zukünftige biologische Forschung sein, sie wird sich zu einer Schlüsseltechnologie des 21. Jahrhunderts entwickeln und vermutlich die moderne Biotechnologie ähnlich revolutionieren wie die Entdeckung der PCR Anfang der 80er Jahre.

Microarray-Systeme ermöglichen durch die systematische Anordnung von DNA-Sequenzen auf planaren Oberflächen und deren anschließender Exposition mit fluoreszenzmarkierter RNA Expressionsanalysen durchzuführen. Die DNA Chiptechnologie bietet die Möglichkeit eine sehr große Zahl von Hybridisierungen an immobilisierten Sonden gleichzeitig durchzuführen und auszuwerten. Dieser hohe Parallelisierungsgrad ermöglicht die simultane Analyse tausender Gene. Hierin besteht der große Vorteil gegenüber klassischen molekularbiologischen Methoden, mit deren Hilfe sich zum einen Veränderungen der Expressionsmuster einzelner Gene nachweisen lassen (mittels Northern Blot oder in situ-Hybridisierung) und zum anderen neue Gene identifiziert werden können, die sich bestimmten Stimuli zuordnen lassen (mittels Substractive Hybridization oder Differential Display). Gegenwärtig ermöglichen diese Techniken in der molekularbiologischen Forschung die Identifizierung und die Expressionsanalyse einzelner Gene. Ein umfassendes und zugleich detailliertes Bild der Veränderungen im Genexpressionsmuster von z.B. sich differenzierenden Zellen erlauben diese Methoden aber nicht und das Wissen um die Funktion einzelner Gene reicht bei weitem nicht aus, um komplexe regulatorische Zusammenhänge, sogenannte "global views", zu erkennen. Einer der wenigen Ansätze, der dieser Herausforderung gerecht wird, ist ein von Ed Southern entwickeltes Prinzip, bei dem einzelne markierte DNA-Stränge mit komplementären DNA-Strängen, die in Form von Gesamt-DNA auf einer soliden Matrix fixiert sind, hybridisiert werden ("Southern-Blot").

Der Einsatz von Robotern, die Verwendung von Glasobjektträgern als Matrix sowie die sich rasant entwickelnde Bioinformatik erlauben nun das Aufbringen und die Analyse einer Vielzahl von Genen auf engstem Raum. Das Prinzip eines Chip-Experiments besteht darin, alle auf dem DNA-Chip befindlichen Genproben gleichzeitig mit einer Nukleinsäureprobe zu hybridisieren. Dazu wird in erster Linie fluoreszenzmarkierte cDNA eingesetzt, die durch reverse Transkription von RNA aus der zu untersuchenden Probe (z.B. Zellen oder Gewebe) gewonnen wird. Das parallele Hybridisieren einer Nukleinsäureprobe mit einer Vielzahl von komplementären Genproben auf einem DNA-Chip führt zu einem charakteristischen Hybridisierungsmuster mit entsprechender Hybridisierungsintensität (Schena et al., 1998). Hier zeigt sich der entscheidende Vorteil dieser Technologie gegenüber anderen Methoden zur Untersuchung von Genexpression. Während sich herkömmliche Methoden auf die Untersuchung einzelner Gene beschränken, liefert ein DNA-Chipexperiment ein komplettes Genexpressionsprofil der zu untersuchenden Probe. Besonders interessant ist das hierdurch gegebene Potential, die Interaktion verschiedener Gene zu untersuchen.

Die DNA Chiptechnologie eröffnet eine Reihe von Applikationen in der biomedizinischen Forschung und Diagnostik, die bisher nur mit aufwendigen Verfahren bis hin zur Sequenzierung größerer Genabschnitte angehbar waren. Darüber hinaus können DNA Chips eine Reihe von langwierigen und teuren diagnostischen Verfahren massiv vereinfachen und beschleunigen. Zu den zukünftigen Einsatzgebieten der DNA Chiptechnologie gehören u.a. die vollständige Detektion aller Polymorphismen eines Individuums zur späteren Entwicklung individueller Medikamente, die Mutationsanalyse von Genen z.B. in der pränatalen Diagnostik genetischer Erkrankungen, die HLA-Typisierung im Rahmen der Transplantationsmedizin, die Identifizierung von Mikroorganismen oder die Analyse komplexer Genexpressionsmuster (Klassifizieren von Genen in funktionelle Gruppen; Klassifizieren von Geweben nach Genexpression; zeitlicher Verlauf der Genexpression; Analyse pathologisch veränderter Genexpression). Weitere Anwendungsmöglichkeiten sind der sogenannte Nutrichip, mit dessen Hilfe pathogene Lebensmittelkeime aber auch gentechnisch veränderte Inhaltsstoffe in Nahrungsmitteln detektiert werden können.

Diese kurze Auflistung zeigt bereits das weitreichende Potential und damit auch die zu erwartenden wirtschaftlichen Aspekte der Chiptechnologie. Die DNA Chiptechnologie wird im Jahre 2005 ein geschätztes Marktvolumen von einer Milliarde US-Dollar übersteigen (Frost & Sullivan, 1999). Darüber hinaus ist davon auszugehen, dass aufgrund ähnlicher methodischer Ansätze eine parallele Entwicklung von Protein-Chips und Lab-Chips stattfinden wird, mit deren Hilfe sich Proteomanalysen durchführen lassen.

Literatur:

  • Ermolaeva et al., (1998), Nat. Genet 20: 19-23
  • Schena et al., (1998), Trends in Biotechnology 16, 301-306
  • Frost & Sullivan report on DNA Microarrays (1999)

Projekte:

  • Analyse dynamischer Genregulation synchronisierter S. cerevisiae Kulturen
  • Transkriptomanalysen zur Optimierung von Kultivierungsbedingungen
  • Optimierung von Produktionsstämmen und Verbesserung des Produktionsprozesses
  • Entwicklung neuer, funktionalisierter Oberflächen für DNA- und Proteinchips
  • Entwicklung humaner und muriner organspezifischer DNA-Chips für Tissue engineering Applikationen und pharmakologisch / toxikologische Fragestellungen
  • Analyse humaner Chondrozyten, Tissue Engineering von hyalinem Gelenkknorpel; Genexpression bei der Chondrogenese, Matrixentwicklung (Zusammenarbeit mit Prof. Matijn van Griensven, MHH).

Bioprozessanalytik und -automation, Chemometrie und Bioinformatik

AK Hitzmann

Prof. Dr. rer. nat. Bernd Hitzmann

Im Arbeitskreis werden Analysensysteme und Algorithmen zur Bioprozessautomation entwickelt. Verfahren der künstlichen Intelligenz werden genutzt, um aus Messsignalen wesentliche Prozessinformation insbesondere auch online zur Verfügung zu stellen. Basierend auf der Analyse von Messsignalen werden theoretische und datengetriebene Modelle entwickelt, die das Wissen über den Prozess erweitern und zu seiner Optimierung und Automation genutzt werden. Basierend auf der Entwicklung von Automationssystemen wird eine computergestützte Prozessführung realisiert. Folgende Themen werden im Arbeitskreis bearbeitet:

  • Entwicklung von Verfahren zur Quantifizierung von Bioprozessgrößen aus 2D-Fluoreszenzspektren:
    Die Auswertung und Interpretation dieser Messsignale mit Hilfe multivariater, wissens- und modellbasierter Methoden stehen im Vordergrund dieser Aktivitäten. Es wird untersucht, welche Information unter Realzeitbedingungen aus den Messsignalen gezogen werden kann, die z. B. aus intrazellulären oder auch extrazellulären Fluorophoren einer Kulturbrühe resultieren, und wie diese Information zum Monitoring des Prozesszustands, zur Überwachung des Prozessverlaufs und zur optimalen Führung von Prozessen verwendet werden kann. Zur Auswertung der Signale werden Verfahren der Faktorenanalyse, insbesondere der Hauptkomponentenanalyse (PCA, PLS), neuronale Netzwerke sowie modellbasierte und heuristische Verfahren verwendet. Die Verfahren werden bei der Kultivierung unterschiedlicher Organismen, im industriellen Bereich bei einer Biotransformation sowie zur Schnittgrenzenbestimmung in der Chromatographie erfolgreich eingesetzt. Für die Entwicklung von Prozessanalysatoren werden spezielle Kalibrationsverfahren entwickelt, die den typischerweise hohen experimentellen Aufwand signifikant reduzieren. Für die Führung von Sauerteigfermentationen wurde der Flurimat entwickelt, der basierend auf Fluoreszenzmessungen Informationen z. B. über den Verlauf des pH-Werts und Säuregrads online zur Verfügung stellt, um eine optimale Prozessführung zu ermöglichen.

  • Entwicklung von Automationssystemen für komplexe Fließsysteme wie z. B. Fließinjektionsanalyse-systeme (FIA-Systeme), HPLC- und Ultraschallresonator-Systeme, die als Prozessanalysatoren eingesetzt werden:
    Ein Schwerpunkt dieser Aktivitäten ist die Bereitstellung eines flexiblen Automationssystems mit modernen Auswerteverfahren, die sowohl für die Entwicklung und Optimierung von Prozessanalysatoren als auch für ihre Anwendung - hier insbesondere im industriellen Onlinebetrieb - Voraussetzung sind. Neben multivariaten Auswerteverfahren (z. B. Hauptkomponentenanalyse und neuronalen Netze) werden auch wissensbasierte Techniken und theoretische Modelle im Automationssystem implementiert, um von einer benutzergeführten Konfiguration eines Systems bis hin zu einer automatisierten Störfalldiagnose des Messbetriebs einen hohen Automationsgrad zu gewährleisten. Speziell für die Signalauswertung von FIA-Systemen werden Auswerteverfahren entwickelt (z. B. das Projektive Referenz-Auswerteverfahren), die eine robuste Quantifizierung selbst gestörter Messsignale erlauben.

  • Entwicklung von Biosensor-FIA-Systemen:
    Für den Einsatz von Biosensor-FIA-Systemen zum Prozessmonitoring und zur Prozessregelung werden spezielle Techniken entwickelt, die zwar den Aufwand der Signalauswertung erhöhen, jedoch den Einfluss von Matrixeffekten sowie die große Verzögerungszeit sonst üblicher Systeme in der Bereitstellung des Messergebnis signifikant reduzieren. So wurde ein FIA-System zur Glucosemessung entwickelt, das ohne Probenahmemodul auskommt und das bei Bakterien- und Hefekultivierungen bereits mehrfach erfolgreich eingesetzt wurde.

  • Bildverarbeitung zur Prozessautomation:
    Im Rahmen dieser Forschungsaktivität wird untersucht, welches Potential die Bildverarbeitung für die Automation von verfahrenstechnischen Prozessen bietet. Algorithmen werden entwickelt, die eine Onlinebildanalyse eines Backprozesses erlauben, sodass trotz schwankender Rohstoffqualitäten und Fehlbedienungen ein Backprozess bestmöglichst geführt werden kann. Dabei werden der aktuelle Zustand des Backguts und seine Entwicklung beim Backen mit Hilfe der Bildverarbeitung identifiziert und für die Automation eines intelligenten Backofens genutzt. Ergebnisse der Bildanalyse eines In-situ-Videomikroskops werden verwendet, um die Führung von Kristallisationsprozessen optimal zu realisieren. Verfahren der künstlichen Intelligenz wurden zur Auswertung digitaler Bilder von Fahrbahnoberflächen mit dem Ziel der Bewertung der Substanzmerkmale untersucht. Neben dem Einsatz von Verfahren aus der digitalen Bildbearbeitung für die Vorverarbeitung des Bildmaterials dienen hier insbesondere neuronale Netzwerke zur automatisierten Erkennung von Oberflächenschäden bzw. zur Klassifizierung des Bildmaterials. Darüber hinaus werden Algorithmen entwickelt, die dazu dienen aus Mikroskopaufnahmen in Echtzeit Informationen über Zellen von Hefekultivierungen zur Verfügung zu stellen. Ein weiteres Gebiet der Bildverarbeitung stellt die Auswertung von Scans von DNA-Chips dar. Die Scans werden analysiert und spezielle Verfahren der Auswertung werden für sie entwickelt, um das Transkriptom von Zellen zu quantifizieren.

  • Analyse und Optimierung von bioverfahrenstechnischen Prozessen:
    Das Ziel dieser Forschungsaktivitäten ist die Bestimmung einer optimalen Führung von biokatalysierten Umsetzungsprozessen. Hierzu werden Verfahren des Data-Minings verwendet, um unbekannte Prozessinformation aus Rohdaten zu extrahieren. Mit Hilfe von mathematischen Modellen, die die Reaktionskinetik sowie Transportprozesse beschreiben, werden Simulationen durchgeführt, um mehr Information über das Prozessverhalten zu gewinnen. Mit Hilfe der Prozessmodelle wird z. B. für Fed-batch-Prozesse eine optimale Feed-Rate berechnet, die eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute gewährleistet. Darüber hinaus wird mit Verfahren der optimalen Versuchsplanung Probenamezeitpunkte sowie Prozessführungsstrategien so bestimmt, dass zu berechnende Parameter mit möglichst kleinen Schätzfehlerkovarianzen bestimmt werden können.

  • Anwendung von Expertensystemen und modellgestützten Verfahren zur Überwachung und Automati-sierung von Bioprozessen:
    Das Ziel dieser Forschungsaktivitäten ist die automatische Führung von Bioprozessen basierend auf der Onlineanalyse der Messsignale. Einen Schwerpunkt hierbei bildet die computerbasierte Identifikation von Störungen im Betrieb von Sensoren und Aktoren (wie z. B. Totalausfall oder Drift) sowie von Variationen im biologischen System, die z. B. durch nicht reproduzierbare Animpfbedingungen, Veränderung der Substratqualität oder Infektionen verursacht werden können. Dabei wird das Erfahrungswissen des Bedienpersonals in einem Expertensystem abgelegt und mit A-priori-Wissen über den Prozess (theoretische Modelle) sowie Verfahren der Zeitreihenanalyse ergänzt, um die Messsignale umfassend zu analysieren. Bei Störfällen soll das Expertensystem den Prozess über heuristische Regel- und Steuerstrategien in Bereiche zurückführen, die wieder mit modellgestützten Methoden handhabbar sind. Ein erweitertes Kalman-Filter dient dabei zur Schätzung von Zustandsgrößen, die auch zur Feed-forward-/Feed-back-Regelung der Substratkonzentration und somit zur optimalen Führung des Prozesses verwendet werden. Die entwickelten Module wurden bei unterschiedlichen Kultivierungsprozessen erfolgreich eingesetzt und ermöglichen beispielsweise die Führung von Fed-batch-Kultivierungen von Hefe auf Glucose bei maximaler spezifischer Wachstumsgeschwindigkeit unter rein oxidativem Stoffwechsel. Diese Regelung ermöglicht die Realisierung von niedrigen Substratsollwerten, wie z. B. Glucosekonzentrationen von 0,1 g/L und kleiner, so dass keine toxischen Metabolite (Acetat bei Bakterien, Ethanol bei Hefen und Lactat bei tierischen Zellen) gebildet werden.